金属蛋白与酶
2 线粒体、Fe–S簇、血红素蛋白与自由基酶
医学背景。线粒体电子传递、铁硫簇装配、血红素代谢和金属酶催化与能量代谢、遗传性线粒体病、感染和肿瘤密切相关。此类体系中的顺磁金属中心和蛋白自由基可作为辅因子状态、配位结构与电子转移异常的直接读出。
线粒体呼吸链
医学背景。呼吸链缺陷会降低ATP生成并改变ROS、NADH/NAD+及铁硫簇氧化态，常见于线粒体病、心肌损伤和神经退行性病变。低温组织谱可保留多个呼吸链顺磁中心。
呼吸链复合物含多种Fe–S簇、黄素和半醌自由基。低温X波段CW能在组织中直接读取还原态中心；脉冲回波检测场扫和DEER可在纯化复合物中辅助谱线归属。组织谱的强度由中心浓度、氧化还原占据和弛豫共同决定。
案例B1-1｜复合物I Fe–S簇的DEER归属
研究内容研究对线粒体复合物I的多个Fe-S簇进行归属，厘清电子传递链内相邻顺磁中心的位置关系。
EPR所说明的问题回波检测与DEER用于分离重叠簇信号并读取簇间偶极耦合，以判定N4和N5的结构归属。
实验设计与参数样品为牛心线粒体复合物I；顺磁对象为还原态[2Fe–2S]+和[4Fe–4S]+簇。采用X波段脉冲回波检测场扫和四脉冲DEER，样品电位约−0.4或−0.3 V、10 K。
主要结果与研究边界N4被归于TYKY亚基第一个[4Fe–4S]簇，N5被归于75 kDa亚基全半胱氨酸配位簇。阶段为纯化复合物机制；限制是谱线重叠且拟合依赖结构模型。
案例B1-2｜线粒体DNA耗竭综合征组织谱
研究内容研究利用DGUOK缺陷动物模型分析线粒体DNA耗竭对肝组织呼吸链的影响。
EPR所说明的问题低温EPR用于识别Fe-S簇和半醌等内源顺磁中心的异常组合，提供组织水平的呼吸链功能指纹。
实验设计与参数样品为DGUOK缺陷大鼠新鲜冻存肝组织；顺磁对象为呼吸链Fe–S簇、半醌及其他内源中心。X波段CW约9.5 GHz，在低温多温点读取。
主要结果与研究边界结果直接显示呼吸链异常并与复合物表达和酶活降低相符。阶段为动物疾病模型；限制是谱峰重叠、组织异质性以及尚无跨实验室诊断阈值。
Fe–S簇与感染/代谢靶点
医学背景。Fe-S簇参与电子传递、酶催化、DNA复制与修复；簇装配或氧化损伤异常可导致代谢病，也可影响病毒和细菌蛋白功能。药物作用需要区分簇破坏、金属替换和蛋白失活。
Fe–S簇的EPR可见性取决于氧化态和自旋态。快速厌氧纯化、受控还原和低温冻存是方法核心；未出现信号不能简单解释为“没有簇”。
案例B2-1｜SARS-CoV-2 nsp12的Fe–S簇
研究内容研究重新判定SARS-CoV-2 RNA聚合酶的金属辅因子，并评价氧化还原活性分子对病毒复制的影响。
EPR所说明的问题EPR用于确认还原态Fe-S簇信号及其受TEMPOL破坏的响应，区分Fe-S辅因子与先前提出的Zn位点。
实验设计与参数样品为厌氧纯化的病毒RNA依赖RNA聚合酶及细胞体系；顺磁对象为还原态Fe–S簇。
主要结果与研究边界低温X波段CW与元素分析、结构和酶活联合，发现两个先前被建模为Zn位点的Fe–S辅因子；TEMPOL可破坏簇并抑制聚合酶和细胞内病毒复制。阶段为病毒靶点机制；限制是体外还原条件与药物暴露不能直接换算成人体剂量。
案例B2-2｜SARS-CoV-2 nsp14/nsp10簇
研究内容研究分析SARS-CoV-2 nsp14/nsp10校对与甲基转移复合体中的金属中心。
EPR所说明的问题低温X波段EPR用于确认蛋白中氧化还原敏感的Fe-S中心，并记录其还原态谱形。
实验设计与参数样品为各50 μM厌氧纯化nsp14或nsp10，0.5 mM连二亚硫酸盐还原后冻存；顺磁对象为Fe–S簇。Bruker E580 X波段CW，9.439 GHz、10 K、5 G调制、20 mW。
主要结果与研究边界研究显示病毒校对/甲基转移复合体含氧化还原敏感Fe–S中心。阶段为纯化病毒蛋白；限制是强还原剂和高蛋白浓度与细胞内环境不同。
血红素蛋白与血红素酶
医学背景。血红素蛋白承担氧运输、药物代谢和过氧化物反应。铁自旋态、轴向配体和质子化状态会随底物、抑制剂及反应中间体改变。
高自旋和低自旋Fe(III)血红素在X波段具有特征g值；配体、更换自旋态和Compound I/II/0等中间体可通过低温CW、功率依赖和快速冻淬研究。对强各向异性低自旋血红素，多频测量常比单一X波段更可靠。
案例B3-1｜高自旋血红素构象关系
研究内容研究系统比较多类高自旋Fe(III)血红素蛋白，建立轴向配位、蛋白构象与谱形之间的经验关系。
EPR所说明的问题EPR以g约6和g约2区域的有效g值及线形判定血红素铁的自旋态和局部配位差异。
实验设计与参数不同高自旋Fe(III)血红素蛋白在X波段的g≈6和g≈2区域被系统比较，建立蛋白构象、轴向配位与谱形之间的经验关系。
主要结果与研究边界样品为纯化血红素蛋白，观测量为有效g值与线形。阶段为方法基础；限制是经验归属存在多解性，需要结构、光谱和配体实验联合。
案例B3-2｜结核分枝杆菌CYP121 Compound 0
研究内容研究用快速冻淬和XFEL结构捕获结核分枝杆菌CYP121催化循环中的早期过氧中间体。
EPR所说明的问题EPR用于在毫秒时间窗识别高自旋Fe(III)-OOH的特征g值，并验证Compound 0的形成与衰减。
实验设计与参数样品为409 μM CYP121–cYY与20 mM过乙酸1:1混合的快速冻淬液和单晶浆液；顺磁对象为高自旋Fe(III)-OOH。X波段CW 9.4 GHz、10 K、1.002 mW、100 kHz、0.6 mT调制，−155°C冻淬5–500 ms。
主要结果与研究边界5 ms出现g≈6.87、5.77、2.00中间体，结合XFEL结构定为Compound 0。阶段为结核药靶机制；限制是高过乙酸浓度以及晶体/溶液反应速率差异。
自由基酶
医学背景。RNR等自由基酶利用受控蛋白自由基完成核苷酸还原和其他难反应。自由基辅因子的形成、转移和猝灭直接关联DNA合成、抗感染与抗肿瘤药物作用。
自由基酶的目标常是鉴定稳定蛋白自由基或冻结瞬态中间体。X波段CW负责存在性、浓度和动力学；ENDOR/ESEEM/HYSCORE用于近邻核结构。部分关键脉冲实验位于Q波段，必须逐项标注。
案例B4-1｜肿瘤细胞RNR酪氨酰自由基
研究内容研究比较多类自由基猝灭剂对完整肿瘤细胞核糖核苷酸还原酶活性的影响。
EPR所说明的问题EPR直接记录RNR酪氨酰自由基强度，量化药物导致的自由基辅因子损失。
实验设计与参数样品为完整Ehrlich腹水瘤细胞；顺磁对象为核糖核苷酸还原酶M2/R2酪氨酰自由基。低温CW-EPR比较羟基脲、焦没食子酚和硫代氨基脲的猝灭效力，范围跨约3个数量级。
主要结果与研究边界公开资料未给精确频率，因此不计入严格X波段统计。阶段为肿瘤细胞药效机制；限制是旧式暴露条件和频段信息不足。
案例B4-2｜细胞内RNR自由基结构
研究内容研究在完整活细菌中测量RNR自由基的浓度、局部结构和自由基对距离。
EPR所说明的问题X波段CW给出细胞内Y122自由基浓度，Q波段DEER与ENDOR补充距离和近邻核耦合信息。
实验设计与参数完整存活大肠杆菌中表达RNR β2；顺磁对象为Y122•和内源Mn2+。
主要结果与研究边界X波段CW 9.6 GHz测得平均体相自由基浓度18±5 μM；Q波段34 GHz完成DEER和Davies ENDOR，显示细胞内自由基对距离和较窄分布。阶段为活细胞机制；限制是脉冲结果采用Q波段，过表达及Fe2+/O2处理可能改变天然占据。
铜、锰及其他金属蛋白
医学背景。Cu、Mn等金属中心参与抗氧化防御、电子转移和细胞死亡调控。价态与配位变化可改变酶活和金属毒性，也是铜死亡等新型细胞死亡研究的重要化学基础。
Cu(II)、Mn(II/III/IV)、Mo(V)、Ni(I/III)等中心可直接观察。CW提供g/A、氧化态和配位对称性；脉冲超精细谱可确定近邻N/H等核；天然金属中心DEER可读取构象异质性。
案例B5-1｜MnSOD的过氧化物酶活性
研究内容研究考察高H2O2条件下人MnSOD的过氧化物酶样反应，并延伸至肿瘤细胞模型。
EPR所说明的问题EPR用于识别羟胺氧化产物和DMPO蛋白自由基加合物，检验异常氧化路径的出现。
实验设计与参数样品为重组人MnSOD及高表达MnSOD的MCF-7细胞；顺磁对象为CAT1H氧化产物和DMPO蛋白自由基加合物。Bruker EMX X波段CW，9.81 GHz、100 kHz调制，蛋白0.25–0.5 mg/mL、DMPO 50 mM、H2O2 1 mM。
主要结果与研究边界结果提示高H2O2下出现过氧化物酶样反应。阶段为蛋白和肿瘤细胞；限制是后续研究指出部分荧光测定可能有光化学伪影，因果解释存在争议。
案例B5-2｜Elesclomol介导细胞铜递送
研究内容研究解析elesclomol-Cu复合物经FDX1还原后向细胞递送铜的分子过程。
EPR所说明的问题EPR确认配合物中Cu(II)的顺磁态及其在FDX1作用下消失，为Cu(II)还原和Cu(I)释放提供直接读出。
实验设计与参数样品为ES–Cu复合物、纯化人FDX1及铜缺乏细胞；顺磁对象为ES–Cu(II)。Bruker 300E室温X波段CW，9.36 GHz、1.0 G/100 kHz调制、25 dB衰减。
主要结果与研究边界EPR确认复合物中铜为Cu(II)，联合遗传和生化结果显示FDX1将其还原并释放Cu(I)。阶段为分子药理和细胞；限制是细胞内路径主要由非EPR实验确定。